Cara menggunakan spektrofotometer UV-Vis: blanko, kuvet, dan kurva kalibrasi

Spektrofotometer UV-Vis mengukur seberapa banyak cahaya yang diserap sampel pada panjang gelombang tertentu. Nilai serapan (absorbansi) dihubungkan dengan konsentrasi lewat kurva kalibrasi. Karena bekerja dengan cahaya yang melewati kuvet, hasil pengukuran sangat dipengaruhi kebersihan kuvet, cara pemakaiannya, dan mutu blanko.

Menyiapkan alat

• Nyalakan instrumen dan biarkan lampu hangat sesuai anjuran pabrik, biasanya 15 sampai 30 menit, agar keluaran cahaya stabil.
• Tentukan panjang gelombang kerja sesuai metode. Untuk pengukuran zat berwarna, panjang gelombang yang dipakai biasanya titik serapan maksimum.
• Pilih kuvet yang sesuai. Kuvet kuarsa diperlukan untuk daerah UV (di bawah sekitar 340 nm). Kuvet plastik dan kaca cukup untuk daerah cahaya tampak.

Langkah pengukuran

1. 1

   Siapkan blanko

   Blanko berisi pelarut dan semua reagen kecuali analit. Blanko yang dibuat dengan pelarut yang berbeda dari sampel akan menghasilkan galat sistematik.

2. 2

   Pegang kuvet pada sisi buram

   Sisi bening (jalur cahaya) tidak boleh disentuh. Sidik jari menyerap dan menghamburkan cahaya.

3. 3

   Bilas dan isi kuvet

   Bilas kuvet dengan sedikit larutan yang akan diukur, lalu isi sampai kira-kira dua pertiga tinggi. Hilangkan gelembung dengan mengetuk lembut.

4. 4

   Lap bagian luar

   Bersihkan sisi bening dengan tisu bebas serat atau kertas lensa. Pastikan tidak ada tetesan atau sidik jari.

5. 5

   Nol-kan dengan blanko

   Masukkan kuvet blanko, tutup ruang sampel, lalu jalankan autozero atau blank. Semua pengukuran berikutnya dibandingkan dengan blanko ini.

6. 6

   Ukur larutan standar

   Ukur seri larutan standar dengan konsentrasi meningkat, dari yang paling encer, untuk menyusun kurva kalibrasi.

7. 7

   Ukur sampel

   Ukur sampel dengan kuvet yang sama dan orientasi yang sama. Bila absorbansi terlalu tinggi, encerkan sampel dan ukur ulang.

Menyusun kurva kalibrasi

Buat sedikitnya lima larutan standar dengan konsentrasi yang menyebar di sekitar perkiraan konsentrasi sampel. Gambarkan absorbansi terhadap konsentrasi, lalu periksa apakah hubungannya lurus dan nilai koefisien determinasi (R²) memenuhi kriteria metode Anda. Absorbansi yang terbaca paling andal umumnya berada di kisaran sekitar 0,1 sampai 1,0. Di luar rentang itu, pembacaan menjadi tidak proporsional; encerkan sampel atau gunakan kuvet dengan panjang jalur lebih pendek.